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广州仪维修

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仪反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系: 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各 引物 各 模板聚合酶 2.5u Mg21.5mmolL 加双或三蒸水至 反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则: 引物长度常用为20bp左右。

引物扩增跨度: 以bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。

ATGC好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

引物3端的碱基,特别是末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。

引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量: 每条引物的浓度或以低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。

催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。

dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或

HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5,小量分装, -20冰冻保存。

多次冻融会使dNTP降解。

在PCR反应中,dNTP应为尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。

浓度过低又会降低PCR产物的产量。

dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。

SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。

提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。

一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接 用于PCR扩增。

RNA模板提取一般采用异胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显着的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为时,Mg2+浓度为1.52.0mmolL为宜。

Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

仪 - 工作原理;

类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:模板DNA的变性:模板DNA经加热至93左右一定时 聚合酶链式反应间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需24分钟,23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

仪荧光化学

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。

现将其原理简述如下:

1)荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。